使用冻存管冻存和复苏细胞怎么做

　　冻存管的使用是一门学问，并不是打开液氮罐、放入冻存管、关上液氮罐这样简单的三部曲可以完成的。科学正确地使用冻存管，可以避免样本的损失，并保护试验人员的安全。

　　01细胞冻存流程

　　1、用预热过的 PBS 对细胞进行冲洗，弃去 PBS 后，加入含 EDTA 的胰酶消化液对细胞进行消化(消化液薄薄地覆盖细胞表面即可，消化液浓度须根据不同的细胞系进行调整)。

　　2、37℃消化细胞 3–5 分钟，不可过度消化。

　　3、一旦细胞从底部脱离，即可用含血清培养基终止消化，并用吸管轻轻吹打以重悬细胞。

　　4、离心(500 × g, 5 min)细胞重悬液以沉淀细胞，弃上清，用含血清培养基对细胞沉淀进行重悬。

　　5、对细胞进行计数(推荐 Neubauer chamber)。

　　6、离心(500 × g, 5 min)细胞重悬液，弃上清。用适当体积含血清培养基重悬细胞。

　　7、将细胞重悬液以 1:1 比例与冻存液(60% 培养基，20% FCS，20% DMSO) 进行混合后转移至 Cryo.sTM 冻存管中。冻存管中细胞的浓度应为 1–5 ×10^6细胞/ml。

　　8、含有细胞的冻存管须按照 −1 K/min 的冷却速率进行冷冻。将冻存管插在含异丙醇的冻存盒小室并放置在−70℃的冰箱中可以实现上述要求。如果 冻存液中含有其他类型的样品时，则需要将 Cryo.s 冻存管在−20℃，−70℃或者液氮的气相层进行直接冻存。为确保每个样品的均一冻存效 果，4 ml 和 5 ml 的 Cryo.s冻存管需在−20℃过夜冻存后再转移至 70℃或者液氮的气相层。

　　9、然后将 Cryo.s 冻存管转移至液氮罐。为避免污染(例如支原体)并考虑到安全预防规范的要求，建议将 Cryo.s 冻存管放置在液氮上方的气相层而非液氮层。

　　02细胞复苏流程

　　1、从液氮罐中取出冻存管后立即将其置于 37℃水浴中进行解冻，解冻时间约 1–2min，解冻时需要不停摇动冻存管令其尽快融化。此步解冻过程越快越好。

　　2、将解冻好的细胞悬液转移到 15 ml 离心管，并立即添加一定量含血清培养基进行混合。

　　3、离心(500 × g, 5 min)细胞重悬液，弃去上清。用适当体积的含血清培养基对细胞沉淀进行重悬后分装到 1 个或多个细胞培养瓶中。

　　4、请遵循细胞接种时的推荐浓度进行培养。

　　5、接下来的 12 个小时细胞需要静置培养。

　　6、细胞换液可在 24–48h 后进行。